Долгов С. Молекулярная селекция земляники

 
 
Сегодня методами генетической инженерии ученые создают новые формы растений значительно быстрее по сравнению с традиционными селекционными подходами, при этом не затрагивая основных агрономических характеристик базового сорта. В молекулярной селекции искомые признаки получают введением отдельных смысловых генов в растительный геном. Скажем, выводят растения, устойчивые к различным болезням, вызываемым фитопатогенами - бактериями и грибами. Другое направление работы биотехнологов - улучшение вкуса плодов. А иногда предоставляется возможность решить обе задачи одновременно.

 
Третичная структура белковой молекулы тауматина в двух проекциях: А - фронтальная, В - латеральная

В природе существует множество белков, которые защищают растения от болезней, вызываемых фитопатогенами — бактериями и грибами. Ученые их классифицировали: в настоящее время известно около 10 групп таких соединений, в частности, семейство PR-5 (pathogenesis-related proteins — белки, устанавливающие отношения с патогенами). Оно объединяет вещества, первоначально выделенные из западно-африканского тауматококкуса (Thaumatcoccus danielli) и широко распространенной кукурузы (Zea mays) и названные по латинским именам этих растений: тауматин-зеаматин-подобные. Позднее выяснилось, что они широко распространены и в той или иной форме присутствуют практически во всех растениях, обеспечивая их устойчивость к фитопатогенным грибам наряду с разрушающим хитин ферментом хитиназой (хитин содержится в структуре грибного мицелия).

 
Схематическое изображение структуры бинарного вектора
 
Формирование тауматина у тауматококкуса приурочено ко времени созревания плодов. В ходе эволюции, по-видимому, возникла спонтанная мутация гена, кодирующего данный белок, в результате чего в периферийной части его молекулы произошли изменения, связанные, в первую очередь, с пространственным расположением остатков лизина. Плоды тауматококкуса стали вызывать у шимпанзе и горилл ощущение чрезвычайной сладости, что им понравилось. Человекообразные обезьяны начали активно их поедать и распространять семена, а это могло способствовать эволюционному закреплению признака. Следует отметить: сладкий вкус тауматина ощущают лишь высшие приматы благодаря присущим им особенностям вкусовых рецепторов. Ни насекомые, ни низшие животные его не чувствуют.
Между тем в наше время недостаточная сладость плодов и ягод — серьезная проблема для производителей сельскохозяйственной продукции во многих странах — Испании, США, Чили, Австралии. И генетики могут приблизиться к ее решению. Так, в экспериментах по повышению устойчивости земляники к фитопатогенам ученые нашей станции с успехом использовали ген, кодирующий суперсладкий белок тауматин-П (один из тауматин-подобных). Последний примерно в 3000 раз слаще, чем сахароза, если сравнивать в весовом отношении, и в 100 000 раз — если рассматривать молярные соотношения. И естественно, возникла идея воспользоваться им не только для защиты растений от болезней, но и для улучшения вкуса плодов и ягод.

 
Плоды трансгенных растений земляники
 
Ген тауматина-II клонировали в Лейденском университете в Голландии в начале 80-х годов XX в. Тогда этот белок попытались использовать в производстве кулинарного и фармацевтического подсластителей, которые были бы полезны в первую очередь для людей, страдающих диабетом. Рекомбинантный ген (примерно 1000 нуклеотидных оснований) интродуцировали в геном бактерий и достигли нужной экспрессии — образования сладкого белка. Однако наладить его широкомасштабное производство тогда не удалось, так как не была решена проблема эффективной экспрессии гена эукариотического организма (высшего растения) в геноме прокариота (организма, не имеющего оформленного ядра и хромосомного аппарата, каким является бактерия). Тем не менее подсластитель, получаемый из природного тауматина, и сейчас производят под коммерческим названием «талин».

В середине 90-х годов XX в. англо-голландская фирма Unelever предоставила российским биологам ДНК гена, кодирующего тауматин-II и на этой основе на нашей станции был сконструирован вектор (В молекулярной генетике вектор — молекула ДНК, способная включать чужеродную ДНК и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желательно изменить. Чаще всего он изготовляется на основе плазмид (прим. авт.))  для трансформации растений. Полученная комбинация, несмотря на простоту — вирусный промотор 35S (инициирует передачу генетической информации) и безинтронная (не имеющая неинформативных участков) смысловая часть с минимальными сигнальными последовательностями (они управляют транспортом и локализацией белков в клетке), — вышла довольно удачной. Применяя ее, ученые ряда институтов РАН и РАСХН создали трансгенные растения яблони, груши, томатов, моркови, картофеля, продуцирующие тауматин-II.

В течение года наши сотрудники проводили испытания нескольких линий трансгенной моркови, в том числе в полевых условиях (совместно с Институтом селекции и семеноводства овощных культур РАСХН). Было установлено: эти растения устойчивы к двум видам патогенных грибов, однако их корнеплоды не обладают выраженной сладостью. Интересно, что томаты, полученные посредством интродукции гена тауматин-подобного белка, демонстрируют и увеличение устойчивости к фитофторозу в условиях защищенного грунта, и ярко выраженную сладость плодов. Аналогичных результатов добились польские исследователи как для томатов, так и для огурцов, содержащих похожую вставку. А в Центре биоинженерии РАН (Москва) наши коллеги, используя ту же конструкцию, вырастили трансгенные формы картофеля с повышенной устойчивостью к ряду фитопатогенов.

Но наилучших результатов сотрудники станции «Биотрон» добились в работе с садовой земляникой (Fragaria ananassa). Был проведен четырехлетний цикл полевых испытаний ее трансгенных линий и отобраны формы с улучшенным вкусом. В то же время они более устойчивы к серой гнили (Botrytis cinerea) — болезни, к которой ни один из известных сортов земляники не имеет иммунитета, приносящей наибольшие потери урожая.

Чтобы получить трансгенную землянику, ген, кодирующий тауматин-II был перенесен в ее геном методом агробактериальной трансформации. При этом специалисты пользуются Ti-плазмидой — маленькой кольцевой молекулой, несущей наследственную информацию агробактерии и ответственной за образование опухолей инфицированных ею растений. В составе Ti-плазмиды есть область Т-ДНК, способная встраиваться в геном растений. Именно в этот участок вводят заданные гены. В нашем случае был сконструирован бинарный вектор, в котором на участке Т-ДНК бактериальной плазмиды находился ген тауматина-II. Кроме того, в вектор ввели ген, придающий устойчивость к антибиотикам, благодаря чему можно впоследствии выявить и отобрать трансформированную клетку среди обычных, не обладающих подобной устойчивостью (своеобразная маркировка).

Полученный вектор перенесли в агробактерию. В качестве экспланта (материала, из которого впоследствии воссоздается или регенерируется целое растение) для экспериментов по генетической трансформации использовали листья растений земляники, которые предварительно культивировали в стерильных условиях in vitro на искусственных питательных средах при определенных температуре и освещении. Растительную ткань инфицировали агробактериями, несущими плазмиду с геном тауматина-II при температуре около 23 °С и отсутствии освещения. Затем несколько месяцев на среде с антибиотиками отбирали клетки с функционирующей вставкой чужеродных генов.

На следующем этапе необходимо было осуществить регенерацию растений земляники из единичных трансформированных клеток, что для культурных сортов, в отличие от модельных растений — табака или арабидопсиса, довольно сложно и зачастую сопряжено с негативными явлениями (соматическими мутациями и вариациями, хромосомными перестройками и другими, ведущими к потере сортовых качеств).

Размножая вновь созданные растения земляники, мы получили более 20 линий, несущих новую наследственную информацию. Но дальнейший анализ показал: ген тауматин-подобного белка проявлялся не в каждой из них. Так, при испытании на устойчивость к возбудителю серой гнили часть трансгенных линий не проявила ожидавшегося иммунитета даже в лабораторных условиях. Что на языке генетиков означает отсутствие экспрессии гена тауматина-II — он «молчит». Подобное явление зачастую обусловлено случайностью его встраивания в хромосому и вероятностью попадания в зону, где он слабо проявляет кодируемые им свойства. Ген может повредиться при переносе, даже «вывалиться», а также подвергнуться модификации, например метилированию. Бывает и так: маркер (в нашем случае ген устойчивости к антибиотикам) переносится, а смысловой ген — нет.

Помимо устойчивости трансгенной земляники к фитопатогенам, мы контролировали вкусовые качества ягод, их размеры, морфологию растений. Все эти признаки невозможно оценить в лабораторных и тепличных условиях, необходимы полевые испытания. Это — неотъемлемый этап анализа трансгенных растений перед их практическим использованием. Ведь известно, что и при классической селекции растений (скрещивание двух форм) из десятка тысяч гибридов отбирают два-три. При использовании методов генной инженерии, в частности регенерации из отдельной клетки, могут также произойти разные изменения, даже не связанные с переносом гена, вследствие чего характеристики полученного растения будут отличаться от исходного сорта.

Полевые испытания мы проводили на сертифицированном Межведомственной комиссией по генно-инженерной деятельности полигоне Института селекции плодовых культур РАСХН в городе Орле. Трансгенные и нетрансгенные растения земляники высаживали на одних и тех же делянках в нескольких случайно распределенных по площади (рендомизированных) повторностях, чтобы нивелировать влияние почвенных условий и прочих факторов на их развитие. Параллельно осуществляли почвенно-агрохимический контроль. А во время цветения растения изолировали пленочными укрытиями, предотвращая неконтролируемый перенос пыльцы.

В конце сезона из 24 линий отобрали только 3, обладавшие всеми необходимыми свойствами: наличием смыслового гена (кодирующего тауматин-подобный белок), присутствием белка и хорошими производственными качествами. Ведь конечная цель — получение трансгенных растений земляники, не имеющих морфологических изменений, таких, например, как развитие карликовых форм. Их вкусовые качества должны быть лучше, чем у исходного сорта, и они обязаны проявлять устойчивость к основному патогену — серой гнили. В большинстве же линий выявили недостатки: либо фенотип отличался от исходного сорта, либо, при наличии гена, не отмечалось достоверного улучшения вкуса. Только в пяти из них ягоды стали слаще, что было статистически доказано.

В настоящее время мы работаем над совершенствованием генно-инженерной конструкции для того, чтобы повысить уровень экспрессии смыслового гена и добиться целенаправленной локализации белка в клетке. Для этого «встраиваем» ген тауматина с различными сигнальными последовательностями, анализируем его клеточную локализацию. И сегодня удалось улучшить конструкцию, первоначально примененную в 1996 г. для получения трансгенной земляники.

Теперь мы обеспечиваем более точную доставку продуктов экспрессии гена, заставляем их накапливаться в различных структурах клетки. Оказалось: для успешного проявления желаемого признака очень важна локализация белка в тканях растения. Так, если мы стремимся получить защиту от фитопатогенов, то последний необходимо «разместить» в межклеточном пространстве. Если же нужно улучшить вкус, то белок лучше аккумулировать в вакуолях.

При получении трансгенных растений можно также не применять гены устойчивости к антибиотикам, что важно для дальнейшего промышленного возделывания культур, особенно потребляемых в свежем виде. Тогда следует взять гены, кодирующие способность усваивать маннозу вместо сахарозы в качестве источника углеводов. Такой прием получил название «позитивной селекции» в отличие от «негативной», использующей для маркировки клеток невосприимчивость к антибиотикам или гербицидам.
На сегодняшний день мы добились повышения устойчивости растений транс генной земляники к возбудителю серой гнили на 25-30%. И это очень хороший результат, ибо абсолютного иммунитета достичь невозможно.

В 2002 г. наш коллектив получил патент на способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам. А в 2005 г. при поддержке Фонда РАН по патентованию российских изобретений был выдан международный патент на заявленный нами способ получения яблонь, томатов, земляники с улучшенным вкусом и повышенной устойчивостью к фитопатогенам.

Итак, исследования, которым посвящена данная статья, ведутся уже 10 лет. В настоящее время наибольший интерес к работе нашей лаборатории по получению трансгенных культур отечественных сортов и изучению биологической безопасности их культивирования проявляет Министерство сельского хозяйства РФ. Ведь, к примеру, яблоки в средней полосе России зачастую довольно кислые. Так что работа по повышению сладости плодов продолжается.
 
Сергей ДОЛГОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, заведующий станцией искусственного климата «Биотрон» филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН