А. Леонтьевский, И. Ермакова. Невидимые санитары планеты


А. Леонтьевский, И. Ермакова

Невидимые санитары планеты

Бурное развитие химической индустрии в XX в. привело к накоплению в окружающей среде синтетических веществ, зачастую токсичных для живых организмов. Для их обезвреживания традиционно применяют физические и химические методы, однако с каждым годом растет внимание к биотехнологиям, более эффективным и экономичным, а главное - экологически безопасным.


ПЕРВЫЙ ШАГ - БИОРЕМЕДИАЦИЯ
В основе этих перспективных методов — использование способности микроорганизмов превращать различные органические соединения в углекислый газ, воду и собственную биомассу. В природе такая переработка осуществляется миллионы лет, благодаря чему происходит круговорот веществ. Сложнее обстоит дело с минерализацией синтетических компонентов в окружающей среде. Но естественная микрофлора проявляет уникальное свойство адаптироваться и к таким источникам питания, в том числе токсичным и устойчивым к разложению, благодаря чему при биотехнологической утилизации жидких и твердых промышленных отходов или очистке почв не образуются побочные продукты и не накапливаются шламы. Заметим: не потребуются и дорогостоящие реагенты, что немаловажно.

Максимального результата в описываемых процессах можно достигнуть, используя отдельные штаммы-деструкторы или ассоциации микроорганизмов, выделенные из почв, длительное время подвергавшихся воздействию загрязнителей, и потому приспособившиеся к выживанию в новых условиях. После отбора наиболее эффективных штаммов необходимо выяснить, будут ли они при последующем использовании безопасны для человека, животных, растений и окружающей среды в целом. Ведь нередко такие микроорганизмы оказываются токсичными, токсигенными или фитопатогенными, а в иных случаях способны препятствовать восстановлению первоначального микробного сообщества в почве. Наконец, при разложении загрязняющего вещества могут появиться устойчивые и еще более опасные продукты.

 
Опытно-технологическая установка в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с биореакторами
для выращивания микроорганизмов
 


Штаммы, прошедшие столь жесткий отбор, далее подвергают процедуре «улучшения» деструктивных свойств: исследуют условия микробиологического разложения загрязняющих веществ, пытаются их оптимизировать для достижения максимальной скорости и полноты уничтожения «целевых» токсикантов. Затем подбирают условия хранения штаммов, позволяющие в максимальной степени сохранить их полезные свойства. Эти детали необходимо принимать во внимание при наращивании активной биомассы для создания микробных препаратов.

Биопрепараты вносят либо непосредственно в загрязненную почву вместе с питательными и некоторыми другими веществами, повышающими эффективность их действия (например, поверхностно-активными, способствующими растворению токсиканта и делающими его более доступным для микробной атаки), либо на специальных материалах-носителях, помогающих выживанию штаммов-деструкторов и/или содержащих упомянутые добавки. При этом необходимы агротехнические мероприятия для активизации микрофлоры, предпочитающей определенный уровень кислотности, влажности и аэрирован-ности почвы. Затем контролируют динамику уничтожения загрязнителя и численность внедренных микроорганизмов. В идеальном случае последние, выполнив свою задачу, погибают в конкурентной борьбе с видами, обитающими в «чистой» почве.

Следуя вышеизложенной схеме, мы сумели выделить штаммы и составить коллекции микроорганизмов, способных к деструкции органофосфонатов и гетероциклических соединений класса морфолинов. Наш интерес к микробному разложению этих веществ был вызван следующим: они встречаются как в составе «обычных» загрязнителей — пестицидов, гербицидов, пламегасителей, антикоррозионных агентов и т.п., так и в составе продуктов нейтрализации химического оружия — зарина, зомана, VX (органо-фосфонаты) или иприта (тиоморфолин). Ряд государств, в том числе и Россия, подписали принятую в 1993 г. Международную конвенцию о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его ликвидации, в соответствии с чем у нас в стране была разработана технология двустадийного уничтожения отравляющих веществ. Вначале осуществляется одна из основных задач: отравляющее вещество в «мягких», контролируемых условиях необратимо превращается в продукт, не пригодный для использования в военных целях, — малотоксичные реакционные массы. На второй стадии последние должны быть сожжены или битуми-рованы (достигается их термической обработкой разогретой смесью битума и гидрата оксида кальция). Образующаяся монолитная битумно-солевая полимерная масса подлежит дальнейшему захоронению.

Но при хранении, транспортировке или уничтожении отравляющих веществ возможно локальное загрязнение почв ими или продуктами их детоксика-ции (могут происходить случайные утечки, аварийные выбросы). И тогда биотехнологические методы незаменимы.
Надо сказать, что одна из специфических особенностей почвы по сравнению с водой или воздухом состоит в сложности оценки степени ее загрязнения токсичными веществами. Суммарное их количество в данном случае — необходимый, но недостаточный показатель, так как увеличение общего содержания может и не приводить к негативному воздействию на экосистему. Однако рост концентрации подвижных соединений, образующихся из исходного загрязнителя, обусловливает его переход в сопряженные с почвой среды (растения, природные воды и т.д.), а значит, таит реальную угрозу для живых организмов.
Существующие способы обеззараживания почвы предполагают обязательную выемку ее и подстилающего грунта и их термическую обработку. На следующей стадии привозят новый мелкозем и рассредоточивают на прежнем месте, стремясь довести концентрацию токсичных компонентов до санитарных норм. И, наконец, наносят обогащенный органическим веществом плодородный слой. Все этапы этой технологии требуют больших финансовых средств. А биоремедиация путем интродукции микроорганизмов-деструкторов в сочетании с агротехническими приемами зачастую является наилучшим решением проблемы: по оценкам экспертов затраты при таком подходе примерно в 1000 раз меньше по сравнению с известными небиологическими технологиями.

КАК ИЗБАВИТЬСЯ  ОТ ОРГАНОФОСФОНАТОВ В ПОЧВЕ?
В структуре молекул органофосфонатов есть прямая связь между атомами углерода и фосфора (С-Р связь). Она химически и термически очень инертна, но может быть расщеплена с помощью ферментных систем микроорганизмов, использующих высвобождающийся фосфор для биосинтеза клеточных компонентов и восполнения энергетического потенциала.

Различают органофосфонаты с прямой активированной (амино- и ацетилфосфонаты) и с прямой неактивированной (алкилфосфонаты) С-Р связью. К первым относится глифосат (ТЧ-фосфонометилгли-цин) — активный компонент множества гербицидов, зарегистрированных более чем в 120 странах. В частности, в России для борьбы с сорняками широко применяют «Раундап». Правда, информация о степени его токсичности, механизме распада в природной среде, влиянии на живые организмы, в том числе человека, противоречива. Согласно прилагаемой к данному препарату инструкции по применению глифосата в его составе, он, попадая в почву, разрушается за две недели. Однако имеются сведения о негативном воздействии последнего на живые организмы, обитающие в почве. Кроме того, высока необратимая сорбция названного гербицида почвенными частицами и последствия этого процесса до конца непоняты.
Представителем органофосфонатов с неактивированной и значительно более прочной С-Р связью является метилфосфоновая кислота — интермедиат в химическом синтезе и продукт детоксикации зарина, зомана, газа VX. Она ухудшает рост растений и очень устойчива к разложению в почве.

Сотрудники лаборатории микробной энзимологии нашего института давно работают над проблемой разложения различных классов ксенобиотиков специализированными штаммами микроорганизмов. Очередным шагом стало изучение биодеструкции органофосфонатов. Для поиска и выделения подходящей для этой цели микрофлоры были взяты образцы почв на полях, многократно обработанных гербицидом «Раундап», и на территории химического предприятия, загрязненной алкилфосфонатами, в частности метилфосфоновой кислотой.

Чтобы отобрать штаммы-деструкторы органофосфонатов, мы использовали метод накопительных культур, когда почву последовательно инкубируют длительное время (до нескольких месяцев) сначала в стационарных условиях при оптимальных для размножения микроорганизмов значениях температуры, влажности, аэрации, а главное, под «селективным давлением» высоких концентраций исследуемого загрязнителя, затем — при интенсивном перемешивании в жидкой среде с органическими и минеральными источниками питания. В наших экспериментах единственными источниками фосфора были глифосат или метилфосфоновая кислота.

Из полученной таким способом ассоциации микроорганизмов мы выделили чистые культуры, потом отобрали наиболее активные бактериальные штаммы, составившие основу коллекции деструкторов органофосфонатов. Они были способны использовать в качестве единственного источника фосфора метил-фосфоновую кислоту или глифосат, а некоторые — оба фосфоната. Созданная нами коллекция пригодна  как для сугубо научных целей (поиск новых ферментов разложения органофосфонатов), так и для разработки нового биопрепарата для очистки почвы.

Избирательность выделенных микроорганизмов в отношении того или иного фосфоната может быть обусловлена особенностями их метаболизма. Нам удалось найти способы воздействия, позволяющие многократно увеличить деструктивную активность штаммов. Например, на начальной стадии культивирования следует использовать «голодные по фосфору» клетки бактерий. Кроме того, нужно поддерживать оптимальные для роста изучаемых бактерий значения рН среды и концентрацию растворенного кислорода.

Выделенные штаммы устойчивы к высоким концентрациям органофосфонатов (до 10 г/л), при этом эффективность их потребления (мг/г биомассы) и накопление фосфора в клетках возрастает с увеличением начальной концентрации токсиканта в среде.
Для того чтобы научиться регулировать деструктивную активность отобранных бактериальных штаммов, меняя условия ведения процесса, мы продолжаем изучать пути метаболизма фосфонатов. Определен характер их взаимодействия с почвой: например, соотношение связанного, сорбированного и свободного глифосата в ней зависит от количества поступившего фосфоната. Мы полагаем, что при существующих нормах внесения гербицидов большая часть глифосата может переходить в связанное состояние. Наш опыт свидетельствует: при интродукции штаммов-деструкторов в почву, загрязненную этим веществом, оно вскоре полностью исчезает, даже в тех случаях, когда начальная концентрация в десятки раз превосходила установленную норму.

СЛЕДУЮЩИЙ ШАГ - ФИТОБИОРЕМЕДИАЦИЯ
Однако вернемся к морфолинам, насыщенным гетероциклическим соединениям, долгое время считавшимся недоступными для биодеградации. Теперь известно: специфическая группа бактерий — микобактерии — способны разрушать связи в их структуре и использовать эти вещества в качестве источника питания, обеспечивающего клетки углеродом и азотом.
Попадая в природные экосистемы, представитель этого класса соединений тиоморфолин может химически или микробиологически модифицироваться в канцерогенный и мутагенный N-нитрозамин и его производные. Описанные выше принципы исследования процессов биодеструкции органофосфонатов были применены нами и для изучения возможности утилизации тиоморфолинов.

Из загрязненных почв мы выделили бактериальные культуры Pseudomonas putida,, трансформирующие эти соединения в присутствии косубстратов — дополнительных источников питания, способствующих росту культуры и разложению «целевого» токсиканта. Кроме того, нашли уникальные штаммы бактерий Alcaligenes xylosoxsydans ssp. xylosoxsydans , утилизирующих тиодигликоль, который также является продуктом гидролиза иприта и в почве при определенных условиях образует полимерную пленку на поверхности капель этого отравляющего вещества, препятствуя тем самым его разложению. Тиодигликоль может накапливаться и сохраняться в природе длительное время, поскольку очень немногие микроорганизмы способны использовать его в качестве источника углерода.

Растения сорго, выращенные в незагрязненной почве (слева), в загрязненной почве (в центре),
в загрязненной почве с внесением в корневую сферу бактерий-деструкторов серосодержащих загрязнителей (справа)
 
 

Сегодня разработка и совершенствование технологий биоремедиации природных сред — область активных фундаментальных и прикладных исследований. Для восстановления почв все чаще прибегают к специально подобранным растениям: они «работают» своеобразными «насосами», выкачивающими загрязнитель посредством своей корневой системы, а затем их собирают и уничтожают в специальных условиях. Этот метод назван фиторемедиацией.

В природных условиях растения формируют взаимовыгодные ассоциации с микроорганизмами, обитающими в корневой и прикорневой области. Они выделяют вещества, служащие для «дружественных» бактерий источником питательных элементов, а те, в свою очередь, могут выделять во внешнюю среду антибиотики и другие соединения, препятствующие развитию патогенной для растений микрофлоры. Ученые, обратив внимание на этот природный феномен, пытаются усилить его эффект. Выделив дружественные для растений бактерии, они могут ввести в состав их генома факторы, определяющие способность разлагать токсичные соединения. Другой путь — «предложить» растениям в качестве обитателей корневой зоны почвенные микроорганизмы, являющиеся мощными деструкторами токсикантов.

Сочетание эффекта фиторемедиации с применением ризосферных бактерий, способных разлагать загрязняющие вещества, выделять соединения, ускоряющие рост растения или оберегающие его от воздействия патогенной микрофлоры, стали называть фитобиоремедиацией. Ныне этот метод широко применяют при очистке территорий от тяжелых металлов, полициклических ароматических углеводородов, пестицидов, радионуклидов. Применительно к проблеме уничтожения химического оружия представляет значительный интерес фитобиоремедиация почв, загрязненных продуктами природного и техногенного разложения иприта. Для этого уже подобраны растения (сорго, овес, подсолнечник), устойчивые к высоким концентрациям названных компонентов и способные аккумулировать их в биомассе.

В сотрудничестве с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов и растений РАН (город Саратов) мы показали: если семена сорго предварительно обработаны клетками штамма Pseudomonas putida, разлагающего тиоморфолин, то к концу вегетационного периода биомасса наземной части и корневой системы этих растений, развившихся в загрязненной почве, не отличается от таковой у экземпляров, выросших на незагрязненной почве. У выращенных же в загрязненной почве из необработанных семян соответствующие параметры снижаются в 2-3 раза. Кроме того, в первом случае общее содержание токсикантов в почве снижалось на 58%, а во втором — лишь на 8%. Неизменным оно оставалось при наличии только аборигенной микрофлоры и в отсутствие растений.

Словом, нужен новый подход к биоремедиации почв, при котором деструктивная активность микроорганизмов в отношении загрязнителей будет сочетаться со способностью растений поглощать последние.
В отличие от бактерий, имеющих узкоспецифичные ферментные системы, ряд грибов обладает комплексом внеклеточных окислительных ферментов, осуществляющих неспецифические реакции. Сочетание высокого окислительно-восстановительного потенциала и неспецифичности (т.е. способности атаковать разные по строению соединения) стало основой для их широкого применения в современной биотехнологии. Так, нами найден штамм гриба-базидиомицета Bjerkandera adusta полностью трансформирующего тиоморфолин в сульфоксид тиоморфо-лина. При культивировании данного гриба в присутствии названного токсиканта индуцируется синтез внеклеточного окислительного фермента — марганец-зависимой пероксидазы.

В настоящее время мы подбираем бактерии, способные проводить последующую деструкцию указанного соединения. Это позволит создать ассоциацию гриб-бактерия, которая может быть использована для полной минерализации тиоморфолина и других веществ данного класса. Итак, в результате целенаправленного поиска микроорганизмов-деструкторов устойчивых токсичных химических соединений — органофосфонатов глифосата и метилфосфоновой кислоты, с одной стороны, и тиоморфолина и тиодигликоля — с другой, мы создали коллекцию штаммов, адаптированных к использованию таких веществ в качестве источника фосфора или углерода. Знание свойств выделенных микроорганизмов позволило многократно увеличить их деструктивную активность путем оптимизации условий культивирования. Все это может быть использовано для разработки научно обоснованных биотехнологий различного назначения.
Описанные работы проводили при поддержке грантов Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП 2.1.1.9227) и Американского фонда гражданских исследований и развития (АФГИР № В11В2-10001-Р1)-05).

Доктор биологических наук Алексей ЛЕОНТЪЕВСКИЙ,
кандидат биологических наук Инна ЕРМАКОВА,   Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
"Наука в России", № 3, 2007