Ралдугина Г.Н. Трансгенные организмы: как и для чего их получают

 
Г. Н. РАЛДУГИНА,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,
Учреждение Российской академии наук ордена Трудового Красного Знамени
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
 
 

ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ: КАК И ДЛЯ ЧЕГО ИХ ПОЛУЧАЮТ
 
 

Многие, наверное, слышали такие слова как ГМО, трансгенные организмы или просто трансгены. Мы постараемся разобраться, что же это такое и как их получают. Сейчас ученые способны переносить и встраивать гены из геномов одних организмов в геномы любых других организмов, относящихся ко всем царствам живого. Такие организмы со встроенными чужеродными генами и называют генетически модифицированными организмами — ГМО или трансгенными организмами. К настоящему времени уже создано много таких изменённых организмов. Это и бактерии, производящие инсулин, и другие необходимые человеку соединения, и животные, дающие, например, молоко со свойствами грудного женского молока, а также множество растений, которые или устойчивы к каким-то соединениям, например, к гербицидам, или сами вырабатывают какие-то полезные человеку белки, например, вакцины или антитела. ГМО создают с помощью генно-инженерных технологий или генной инженерии.

Генная инженерия — направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которой является получение организмов с новыми, в том числе не встречающимися в природе комбинациями наследственных свойств. В её основе лежат достижения молекулярной биологии и, прежде всего, установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Кроме того, успехам генной инженерии способствовала разработка возможности объединения in vitro (в пробирке) генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК, т.е. создание рекомбинантных молекул. Поэтому генную инженерию называют ещё и техникой рекомбинантных ДНК. Таким образом, генная инженерия - это совокупность приемов, позволяющих исследователю путём операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного - бактериям, растениям и др.).

Каковы возможности генной инженерии?
1. Можно «скрещивать» индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.
2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.
3. Заранее можно предсказать результат скрещивания, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

Как же можно с помощью генной инженерии создать ГМО и какие методы существуют для этого?
Для того чтобы получить трансгенные организмы нужно выполнить несколько последовательных действий.
Во-первых, надо создать вектор, то есть самостоятельно реплицирующуюся молекулу ДНК. Термин репликация (от позднелат. replicatio — повторение) обозначает самовоспроизведение нуклеиновых кислот (обычно ДНК, у некоторых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности, т.е. последовательности, у которых структуры двух молекул соответствуют в пространстве, благодаря чему возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмолекулярных взаимодействий. Вектор способен включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Векторами они названы за способность осуществлять процесс переноса направленно, по желанию экспериментатора.
Во-вторых, надо знать, какой ген необходимо встроить в организм, чтобы придать ему желательные свойства, и иметь этот ген.
В-третьих, надо разработать методы переноса, чтобы векторная молекула с необходимыми генами проникла в клетки изменяемого организма и встроила в клеточный геном чужеродные гены.
И, в-четвертых, необходимо правильное конструирование векторной молекулы, чтобы встроенный ген полноценно экспрессировался в клетке. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Однако обычно их создают на основе ДНК плазмид или вирусов (в том числе бактериофагов).

Плазмиды — это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные размножаться (реплицироваться) в клетке независимо от цикла размножения клетки. «Дикие» плазмиды очень широко распространены в природных бактериальных популяциях и способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой в процессе «конью-гации» — аналога полового размножения. Многие плазмиды содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д. Наличие в плазмидах таких генов делает их присутствие в бактериальных клетках выгодным и способствует их размножению. Плазмиды стали настоящим подарком для молекулярных биологов, сейчас на их основе созданы многие современные «векторные» системы, используемые в генной инженерии. Если основная бактериальная ДНК имеет длину более 100 тысяч пар оснований, то размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. Они легко выделяются и очищаются.

Большое количество векторов создано на основе бактериофагов. Они позволяют вводить чужеродную ДНК в ДНК-фаг. Причем, вставляемый фрагмент ДНК может быть значительно большего размера, чем при использовании плазмидного вектора.


ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНОВ

Ген, который хотят ввести в трансформируемый организм, чтобы придать ему новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса.

Ген можно получить несколькими путями.
1. Выделение гена из ДНК каких-то организмов, у которых определена нуклеотидная последовательность геномов и известна функция многих генов, например, из Arabidopsis thaliana, который является модельным растением во множестве исследований, или из бактерий, так как последовательность геномов многих бактерий в настоящее время известна. Выделение генов из ДНК проводят с помощью специальных ферментов рестрикт Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх до шести пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Однако этот метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать ферменты, которые могут точно вырезать из ДНК нужный ген. Вместе с последовательностью его нуклеотидов захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
2. Выделение гена из ДНК с помощью химико-ферментного или ферментного синтезов. Таким способом ген можно синтезировать, зная первичную структуру белка, кодируемого желаемым геном, или с помощью обратной транскрипции РНК, выделенной из соответствующего организма. Термин транскрипция (буквально — переписывание, от лат. trans— через, пере и scribo — черчу, пишу) — это процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы; происходящий во всех живых клетках. Транскрипция катализируется ферментом, который называется ДНК-зависимая РНК-полимераза. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу,
т.е. по матричной цепи ДНКРНК-полимераза движется в направлении 3->5. Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ

Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена — это структурные элементы: промоторы, которыми являются последовательности нуклэотидов ДНК, расположенные перед началом участка гена, кодирующего белок или РНК, и узнаваемые ферментом РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции, а также терминаторы и энхан-серы Терминатор — это последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за прекращение транскрипции. Добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы. Для растений часто используется терминатор-ная последовательность гена нопалинсин-тазы из Agrobacterium tumefaciens. Энхан-серы — последовательности ДНК, усиливающие транскрипцию при взаимодействии со специфическими белками. Они могут находиться в любой части генома, а их взаимодействие с работающим геном происходит за счет четвертичной структуры ДНК. Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эука-риотического, только в прокариотическом организме. В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений (животных) к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но, если в растительную (животную) клетку переносится бактериальный ген, то его прокариотический промотор должен быть заменен на соответствующий эукариотический. Для растений часто используют промоторы от растительных вирусов, которые эволюционно приспособлены к функционированию в растительной клетке.

Промотор может быть сильным и слабым. Сильный промотор инициирует синтез мРНК часто, слабый — гораздо реже. При этом очень важно при конструировании вектора не изменять последовательность оснований промотора, которая определяет частоту инициации синтеза мРНК. Замена даже одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз. Ген должен быть встроен в векторную молекулу, способную доставить его в клетку растения, чтобы. создать специальную генетическую конструкцию, которая могла бы экспрессироваться, т.е. была бы активна в клетке. Экспрессия генов — это процесс, в котором наследственная информация гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков. Существуют гены, кодирующие РНК (например, рРНК, тРНК), которые экспрессируются (транскрибируются), но не транслируются в белки.
Таким образом, генетическая конструкция или генетическая кассета должны выглядеть, как на рис. 2.

Затем эту генетическую конструкцию встраивают в плазмиду, которую каким-либо образом вводят в клетку с тем, чтобы гены встроились в клеточный геном.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ?

Мы выяснили, что смысл генно-инженерных манипуляций состоит в переносе целевого гена в геном клетки-мишени и его экспрессии в новом генном окружении. Логика проведения такой манипуляции мало меняется в зависимости оттого, какой целевой ген будет использован и клетки какого организма подвергнутся изменению. Главное, что после получения трансформированной изменённой клетки из неё можно получить полноценный организм. При этом подходы к формированию организма зависят от того, какая клетка — бактериальная, растительная или животная — служила мишенью для трансформации.
В случае бактериальной клетки либо клетки другого одноклеточного организма (например, дрожжей), получение трансгенного организма ограничивается непосредственным переносом гена в клетку-мишень. Клетка одноклеточных сама по себе — самостоятельный полноценный организм. Деление такой клетки приводит к появлению идентичных организмов с теми же свойствами, что были приобретены исходной трансгенной - материнской клеткой.

Для получения трансгенного животного в качестве клетки-мишени используют половую клетку — яйцеклетку. После трансформации в ходе естественных процессов развития яйцеклетка превращается в полноценный автономный организм. Передача новых признаков в поколениях невозможна, если процесс трансформации не затронул половые клетки.

Растения имеют важное преимущество перед животными, а именно — возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных растений. Это свойство (тотипотентность) дает возможность получать генетически модифицированные (трансгенные) растения и изучать функционирование введенных в растения генов.

Вводить в геном растительных клеток гены, кодирующие нужный белок, пробовали разными способами, однако они все были малоэффективны. Удобный способ доставки чужих генов был подсказан самой природой — трансформация растений с помощью почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes.  Как и у большинства других бактерий, I часть их генома находится не в основной хромосоме, а в плазмидах. Ti-плазмиды (tumor-inducing, опухолеобразующие), найденные в Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмиды (root-inducing, корнеобразую-щие) в Agrobacterium rhizogenes, оказались лучшим инструментом для генной инженерии.

Агробактерии являются мезофильными обитателями почвы, среди них встречаются как сапрофитные (A. radiobacter), так и фитопатогенные (A. tumefaciens, A. rubi, A. rhizogenes, A. vinis) виды. Это короткие, подвижные грамотрицательные палочки с перитрихиальными жгутиками.
 
Опухолевый рост у растений, индуцированный патогенными штаммами Agrobacterium, представляет собой особый случай паразитизма: паразит (агробак-терия) изменяет обмен веществ в клетках хозяина, вводя свою генетическую информацию в его геном. Такое явление получило название «генетическая колонизация». Ферментативный механизм растения, отвечающий за транскрипцию собственной ДНК и синтез белка, распознает чужеродную ДНК из бактерии как свою собственную и транскрибирует ее вместе с обычными растительными генами.

В природе образование опухоли начинается с повреждения стебля растения у самой земли. Агробактерии могут трансформировать растение только при наличии пораненной растительной ткани, которая теряет различные вещества, входящие в состав клеточных стенок (глюкозу, глюкуроновую кислоту, галактозу, галактуроно-вую кислоту, арабинозу, маннозу, фукозу, целлобиозу и ксилозу), а взамен в ней начинают синтезироваться специальные вещества — предшественники лигнина, являющиеся сигнальными молекулами для начала инфекции — ацетосирингон и гидро-ацетосирингон, способствующие залечиванию раны.
 
Патогены чувствительны к ним и начинают двигаться к поврежденному участку ткани по градиенту концентрации этих веществ со скоростью 60 мкм/сек, а затем прикрепляются к клеткам растения в местах повреждений. После прикрепления бактерий к поверхности клеток растения они начинают образовывать целлюлозные фибриллы, которые видны при микроско-пировании уже через 90 мин после добавления бактерий и к 10 часам инкубации формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий, за счет чего увеличивается множественность заражения. В результате размножения образуются скопления бактерий на поверхности растения. Передача ДНК от бактерий в растительную клетку происходит при плотном контакте бактерий с плазмалеммой растительной клетки, который обеспечивается вследствие повреждения клеточных стенок ферментами, выделяемыми бактериями и растворяющими пектины клеточной стенки.

Для чего же нужно бактериям встраивать свои гены в клетки растения, изменяя их метаболизм?
В растениях со встроенных бактериальных генов начинается синтез фитогормонов цитокининов и специфических, используемых только агробактериями, веществ — опинов. Синтез дополнительного количества гормонов в растительной клетке приводит к сдвигу баланса гормонов в клетке и, как следствие, к неуправляемому росту клеток, ведущему к образованию опухоли. Эти вещества — опины используются бактериями в качестве источника углерода и азота, что создаёт для них селективные преимущества, т.к. только агробактерии имеют гены, ответственные за деградацию этих соединений.
Геном A. tumefaciens состоит из 2-х частей — из большой линейной хромосомы (2 млн пар оснований) и значительно меньшей кольцевой хромосомы (206479 пар оснований). Именно эта кольцевая хромосома и носит название Ti-плазмиды (см. выше).

Гены, вызывающие формирование галлов на растении, локализованы по большей части на Ti-плазмиде. Agrobacterium tumefaciens имеет очень широкий круг растений-хозяев и может инфицировать практически все двудольные растения. Долгое время считалось, что однодольные растения не чувствительны к агробакте-риальной инфекции. В настоящее время показано, что при соблюдении определенных условий агробактерии могут инфицировать и однодольные растения, в частности представителей таких семейств, как Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae и некоторых других. Однако существуют определенные вариации круга хозяев для различных штаммов Agrobacterium: некоторые штаммы способны вызывать галлообразование на отдельных видах растений, но не инфицируют другие. Различные сорта одного и того же растения также могут иметь различную чувствительность к данному бактериальному штамму. В отличие от A. tumefaciens, A. rhizogenes фактически инфицируют все виды растений, как двудольные, так и однодольные.

Ti-плазмида представляет собой кольцевую двунитевую ДНК, которая несет гены, участвующие в образовании опухоли. В растение переносится часть плазмиды, которая называется Т-ДНК (от англ. transferred DNA, т.е. «переносимая ДНК»), на которой локализованы гены синтеза ферментов, вызывающих формирование опухолей на растении, а также гены синтеза опи-нов. Ti-плазмида содержит также w'r-гены, которые экспрессируются под воздействием сигнальных молекул и являются ответственными за синтез, вырезание и перенос Т-ДНК, но сами в геном растения не переносятся.

Индукция vir генов обратима, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена, поскольку в том случае, если инфицируется больной и/или нежизнеспособный организм, то перенос Т-ДНК в его клетки не осуществляется. После активации w'r-генов в оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК переносится в растительную клетку. Похожим образом у бактерий происходит половой процесс, когда микробы просто обмениваются копиями плазмид.

Т-ДНК, являясьфрагментомТ1-плазмиды, ограничена двумя прямыми повторами из 25 нуклеотидов, которые «обманывают» ферменты растительной клетки, заставляя их принять Т-ДНК за родную и встроить ее в собственный геном. Правый конец обозначается П (RB — right border), левый соответственно Л (LB — left border). Для нормального переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять встраивание Т-ДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью неинфекционными. В то же время замена правой границы как на искусственно синтезированную, так и на левую восстанавливает вирулентность бактерии. Любой фрагмент ДНК, помещенный между этими границами, может быть перенесен и встроен в ядро растительной клетки. Максимальный размер фрагмента ДНК, который может быть перенесен, пока не определен.

На рисунке приведена схема генетической трансформации клетки. Фенольные компоненты пораненной растительной клетки запускают экспрессию генов vir-области Ti-плазмиды. vir-белки вырезают Т-область из плазмиды, образуя Т-цепь. Затем Т-цепь и vir-белки нескольких типов переносятся в растительную клетку через транспортные каналы. Внутри клетки vir-белки взаимодействуют с Т-цепью, формируя Т-комплекс. Этот комплекс попадает в ядро, позволяя Т-ДНК интегрировать в геном растения и экспрессировать встроенные гены

После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. При этом одна из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком ДНК клетки-хозяина может включиться в хромосому или внехромосом-ную единицу.

У Ri-плазмид имеются общие черты с Ti-плазмидой, в том числе гомологичная vir-область. Её Т-ДНК также содержит гены, кодирующие опины и два гена синтеза ауксина и, кроме того, ещё в ней присутствуют специальные гены, называемые гогенами, которые и способствуют образованию опухоли в виде пучка корней.

Ti- и Ri-плазмиды оказались прекрасным инструментом для переноса генов в хромосомы растений. В начале 80-х гг. XX в. различными группами исследователей Ti-плазмиды были модифицированы путем удаления онкогенов (генов синтеза фито-гормонов и опинов) из области Т-ДНК; также из агробактерий была удалена вся лишняя ДНК, не нужная при клонировании ДНК. Клонирование в биологии — это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена. Первоначально слово клон (от греч. ветка, побег) применялось для группы растений (например, фруктовых деревьев), полученных вегетативным способом от одного растения-производителя. Эти растения в точности повторяли качества своего прародителя и могли стать основателями нового сорта. Позже клоном стали называть не только всю такую группу, но и каждое отдельное растение в ней, а получение таких потомков — клонированием.
 
Со временем значение термина расширилось, и его стали применять в микробиологии, для методики выращивания культур бактерий — потомков одной клетки. Кроме того, в Ti-плазмиду был также добавлен сайт инициации репликации, вырезанный из плазмиды кишечной палочки E, coli, чтобы можно было клонировать в ней плазмиды. После переноса с их помощью ДНК в ядро растительной клетки нормальный рост растения не нарушался. После этого оставалось вставить в Т-ДНК нужные гены: один или несколько целевых и не менее двух маркерных, которые позволяют отобрать сначала клетки кишечной палочки, а потом растительные, в которых перенос генов прошел удачно - ген устойчивости к определенному антибиотику или кодирующий светящийся белок, и т.п.

В растениях, трансформированных такими плазмидами, опухоли уже не образуются, и не происходит синтеза опинов. «Обманутая» человеком бактерия, внедряя свою ДНК в хромосому растения, в свою очередь «обманывает» геном растения, который после этого начинает синтезировать необходимые человеку продукты.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА ДНК В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ

В настоящее время применяются две основные группы методов переноса ДНК в клетки растений: прямые и агробактериальные.

I. Прямой перенос ДНК в растительную клетку

При этом способе используются различные химические и физические методы:
электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), ионов Са2+ и высокие значения рН. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако иногда без них не обойтись. В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, или ионов Са2+ и высокого рН) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты, т.е. клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань ферментами, растворенными в осмотике разрушающими пектин и целлюлозу - пек-тиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются многоатомные спирты (маннит или сорбит) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после переваривания клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых могут образоваться растения-регенеранты.

1. Электропорация основана на том, что импульсы тока высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты (Пр) и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350В, длительность импульса 30-60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цито-плазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил.
2. Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, протопластов ионов Са и высоких значений рН. В этом методе для трансформации также используют протопласты, добавляя к ним специальные соединения (раствор ПЭГ, хлористый кальций, щелочь), добавляют плазмиду и инкубируют в течение 20-30 мин. ПЭГ и ионы Са2+ воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза. Пиноцитоз (от греч. pfno — пью, впитываю и kytos — вместилище, здесь — клетка) — захват клеточной поверхностью жидкости с содержащимися в ней веществами. Один из основных механизмов проникновения в клетку высокомолекулярных соединений, в частности белков и углеводно-белковых комплексов. При пиноцитозе на плазматической мембране клетки появляются короткие тонкие выросты, окружающие капельку жидкости. Этот участок плазматической мембраны впячивается, а затем отшнуро-вывается внутрь клетки в виде пузырька. Пиноцитозные пузырьки способны перемещаться внутри клетки, сливаться друг с другом и с внутриклеточными мембранными структурами. В клетке мембранная оболочка растворяется, и ДНК встраивается в геном клетки.

3. Трансформация с помощью биологической баллистики (биолистика или бомбардировка). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно для трансформации однодольных видов. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносятся на пластиковую пулю и помещаются внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10-15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0.1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0.6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органельные геномы.

II. Перенос ДНК с помощью агробактерий
Другая наиболее распространенная группа методов — трансформация с помощью Л. tumefaciens или Л. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования в течение некоторого времени (от 2-3 мин до 2-3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation) растительных эксплантов, то есть кусочков каких-либо частей растения, которые затем переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий.

Этот метод достаточно универсален и пригоден для многих видов растений, хорошо образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени было получено большинство трансгенных растений различных генотипов. Однако сложностей хватает и при использовании агробактериальной трансформации. Основными трудностями являются — отсутствие универсальных методов переноса генов в клетку, сложность получения соответствующих систем культуры тканей и регенерации растений.

Регенерация (от позднелат. regeneratio — возрождение, возобновление) в биологии — восстановление организмом утраченных или поврежденных органов и тканей, а также восстановление целого организма из его части. Регенерация наблюдается в естественных условиях, а также может быть вызвана экспериментально. У растений регенерация может происходить на месте утраченной части или на другом месте организма. Обычно, однако, под регенерацией понимают восстановление насильственно отторженных частей. При такой регенерации организм, прежде всего, использует основные пути нормального развития. Поэтому регенерация органов у растений происходит преимущественно путём репродукции — отнятые органы компенсируются развитием существующих или образующихся вновь заложений. Так, при отрезании верхушки побега усиленно развиваются боковые побеги. Или поверхность ранения на стволе или ветке может покрыться так называемой раневой перидермой; а также рана может зарубцеваться наплывами (каллюсами). Размножение растений черенками или кусочками листьев — простейший случай регенерации, когда из небольшой вегетативной части восстанавливается целое растение.

Успех получения трансгенных растений зависит от множества факторов, поэтому в каждом конкретном случае приходится подбирать строго индивидуальные условия трансформации для каждого генотипа растения.

ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ

После проведения процедуры трансформации, начинается процесс образования растений-регенерантов. Однако следует иметь в виду, что чужеродные гены будут находиться не во всех образовавшихся растениях. Как известно, частота трансформации (отношение числа эксплантов с трансформированными побегами к общему числу эксплантов), независимо от использованных методов трансформации, достаточно мала. В связи с этим в генетической инженерии растений, также как и в генетической инженерии животных, большое значение имеет возможность отбора трансформированных организмов.

Для этого обычно используются специально встраиваемые для этого в вектор селективные и маркерные гены. Наиболее распространенными селективными генами являются бактериальные гены устойчивости к антибиотикам (прокариот-ный ген неомицинфосфотрансферазы nptll, придающий трансгенным растениям устойчивость к канамицину, или hpt ген — устойчивость к гигромицину) или гены, делающие растения устойчивыми к гербицидам (bar — к биалофосу; dhfr — к метотрексату; esps — к глифосату). При помещении эксплантов на среды, в которых присутствует селективный агент, образовавшиеся из трансформированных клеток побеги остаются живыми, а остальные погибают.

Однако использование селективных соединений имеет свои недостатки. Хотя эти селективные гены эффективно экспрессируются в большинстве растений, но некоторые виды растений чрезвычайно чувствительны к самим селективным соединениям, что приводит к массовой гибели растительной ткани (даже трансформированной) на селективной среде. Другие же виды растений могут быть устойчивы к высокой концентрации селективного фактора, что также затрудняет отбор трансформантов. Кроме того, эффективность отдельных соединений как селективных агентов способна меняться в зависимости от типа выбранного экспланта или вида ткани.

В качестве маркерных генов часто используются какие-либо нерастительные гены, обусловливающие либо легко тестируемую энзиматическую активность, например, бактериальный ген gus, ферментный белок которого при взаимодействии со специальным субстратом окрашивает ткани растений в синий цвет. Также применяются гены-«репортеры» — индикаторные гены, например, ген зеленого флуоресцирующего белка медузы, gfp (green fluorescent protein), светящийся в ткани растения ярко-зелёным светом. При использовании маркерных генов важными факторами являются простота, дешевизна и специфичность методов детектирования.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ТРАНСГЕННОСТИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ, Т.Е. НАЛИЧИЕ В ИХ ГЕНОМЕ ТРАНСГЕНА

После первоначального отбора трансформированных растений или тканей с помощью маркерных или селективных генов необходимо доказать присутствие вводимого целевого гена с помощью различных молекулярных методов, таких как ПЦР или ДНК-гибридизация. ПЦР — полимеразная цепная реакция. Этот метод специально разработан для исследования нуклеиновых кислот. Заключается в том, что из анализируемого растения выделяют ДНК, которую помещают в специальные пробирки и туда добавляют два синтетических олиго-нуклеотида — праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из З'-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают (денатурируют) для разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками — затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл). Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2п, где п — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами. Получаемый сегмент ДНК выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их специальным красителем для ДНК — этидиум бромидом.

ДНК-гибридизация (Саузерн-блоттинг — Southern-blotting) — это также метод исследования ДНК. При использовании этого метода можно доказать не только то, что искомая последовательность ДНК присутствует в геноме, но и число встроенных копий этой последовательности. Исследуемую ДНК разрезают на фрагменты с помощью специальных ферментов рестриктаз, разделяют с помощью электрофореза, подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например, на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый (радиоактивно или флуоресцентно) ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п.н.) также денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и гибридизуют с полученными фрагментами ДНК. Для удаления негибридизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается, т.е. встраивания чужеродной ДНК не произошло.


НАСЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕНОВ

Наследуемость встроенного гена наряду с доказательствами с помощью молекулярных методов является доказательством трансгенности полученных после трансформации растений. Присутствие введенного гена у потомков изучают теми же методами, которыми первоначально доказывают трансгенность полученных растений:
а) определяя наличие гена в геномной ДНК трансгенного организма (ПЦР и Саузерн);
б) оценивая уровень транскрипции введенного гена методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который заключается в том, что из растений выделяют РНК, на которой с помощью фермента, называемого ревертазой, синтезируют ДНК (к-ДНК), затем ставят обычную реакцию ПЦР; в) контролируя экспрессию гена по конечному белковому продукту или по тому эффекту, который этот белок вызывает.
 
Использование разных методов для доказательства истинной трансгенности данного растения необходимо для того, чтобы исключить «псевдотрансгенные» черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью, химерностью или неполным удалением агробактерий.

Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычно встраиваются в ядерный геном и, как правило, наследуются в соответствии с законами Менделя. Если трансгены в потомстве самоопыленных трансгенных растений наследуются как единый менделевский признак, сегрегируя в отношении 3:1, то это говорит о том, что вставка гена произошла в отдельный хромосомный сайт, то есть чужеродная ДНК в высших растениях, по-видимому, локализована как любая эндогенная мутация, даже если место встраивания Т-ДНК у разных трансформированных клеток не совпадает (встройка произошла в различные участки одной и той же хромосомы или в разные хромосомы или в несколько различных локусов). В случае проведения перекрестного опыления с нетрансформированным растением наследование трансгена должно быть в соотношении 1:1. В некоторых случаях наследуемый ген может распределяться в потомстве самоопыленных растений с другой частотой, например, 15:1 (в случае 2-х вставок).

При проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако и после интеграции могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза, ингибируя экспрессию встроенных генов. В таких случаях только перекрестное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желательным генотипом и фенотипом дает потомство с предсказуемыми признаками. Тем не менее, в некоторых случаях при проведении перекрестного опыления с нетрансгенными растениями (анализирующее скрещивание) образования семян может не происходить или они могут образовываться в очень маленьком количестве.

После того, как получено несколько поколений трансформированных растений и показано, что встроенные гены наследуются и экспрессируются в них постоянно, полученные растения обязательно должны быть проверены на биобезопасность.

У полученных трансгенных растений кроме заданного измененного признака, зависящего от вставленного целевого гена, совершенно не должны быть изменены его свойства, зависящие от используемого для трансформации генотипа. Надо понимать, что с помощью генетической инженерии не создают совершенно новые растения, а только «улучшают» уже адаптированные к определенным условиям внешней среды и к технологиям возделывания сорта и гибриды. Перед изменением растений обязательно продумывается комплексная селекционно-агротехническая программа, в которой определяются цели и этапы использования классических и биоинженерных методов управления наследственной изменчивостью при использовании того или иного сорта (гибрида) трансформируемого растения. Можно, однако, ожидать, что получаемые в результате трансформации ГМО не будут обладать желаемыми свойствами, или же возникнут какие-то дополнительные свойства, полезность или вредность которых надо еще дополнительно выяснять.

Получив трансгенное растение, в первую очередь оценивают его эквивалентность с традиционным аналогом, т.е. нетрансфор-мированным растением — не появились ли после трансформации какие-то отличия. Не должны меняться ни морфология созданного ГМ организма, ни его внутренние свойства, ни химический состав продуктов, которые образуются растением. Продукты, образуемые ГМ организмом, должны быть как композиционно, так и по составу абсолютно аналогичны продуцируемым традиционным аналогом. В обязательном порядке необходимо проверить, не приобрели ли вновь созданные ГМ организмы способность продуцировать токсичные, аллергенные, тератогенные или иные опасные и/или нежелательные вещества, препятствующие использованию полученных из них продуктов в пищевых или кормовых целях.

Необходимо все растения, которые получают методом трансформации, тщательно анализировать по всем признакам, чтобы быть уверенными, что введенная конструкция, содержащая чужеродный целевой ген, ничего не нарушила в геноме хозяина, что нет никаких фенотипических и нежелательных физиолого-биохимических изменений. Только после комплексных многосторонних исследований полученные трансгенные растения, обладающие новыми полезными для человека свойствами, могут быть размножены и использованы в производстве различных продуктов, особенно продуктов питания человека и животных.

ПОЛУЧЕННЫЕ К НАСТОЯЩЕМУ ВРЕМЕНИ ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ

К настоящему времени над созданием трансгенных растений работают многие группы учёных. Большинство ГМО получают ля исследовательских целей, например, для изучения биохимии и генетики организмов, вставляя новые гены или выключая имеющиеся. Но основное, что интересует многие фирмы и группы исследователей — это возможность создания трансгенных организмов, обладающих наряду с устойчивостью к гербицидам и вредителям улучшенными питательными или лекарственными свойствами, которые превосходили бы традиционные сорта. Существует множество примеров этого. Почти каждый день в прессе появляются новые сообщения. Мы приводим в данной статье только некоторые, наиболее интересные на настоящий момент примеры.

Так, например, в США поступило в продажу соевое масло с низким содержанием линоленовой кислоты; в Австралии создан сорт кресс-салата, обогащенный полиненасыщенными омега-3 жирными кислотами, которые снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний; выведены ГМ-сорта томатов с вакциной против атипичной пневмонии; картофеля, снижающего риск заражения гепатитом В, а также риса с вакциной от аллергических реакций типа сенной лихорадки; в Японии создан ГМ-сорт сои, обогащенной новокинином (в природе содержится преимущественно в яичном белке), который улучшает рост волос и замедляет их выпадение при химиотерапии за счет синтеза новых кровеносных сосудов и улучшения микроциркуляции в коже головы.

Растения могут быть также использованы в качестве источника биотоплива. В настоящее время наиболее распространенным видом биотоплива для транспортных средств является этиловый спирт, который получают путем ферментативной переработки пшеничной и кукурузной соломы, а также сельскохозяйственных отходов, в основном состоящих из целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина, а также других компонентов клеточных стенок. Из этих растительных остатков путем ферментативной обработки получают спирт, химически идентичный спирту, полученному из пшеницы или сахара, но более дешевый. При увеличении размера клеток растений в процессе их роста естественно будут увеличиваться и их клеточные стенки. Ученые из университета Пердью (Purdue University) под руководством Дэна Шиманского (Dan Szymanski) на модельном растении из семейства капустных — Arabidopsis изучили функцию белка, регулирующего гены ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки. При встраивании гена этого белка в другие растения, образующие большую растительную массу (например, кукурузу), можно изменить размер и форму клетки, увеличив число целлюлозных молекул, то есть, значительно увеличить количество сырья, необходимого для производства биотоплива.

Кроме того, в настоящее время производят трансгенные растения не столько для питания, сколько для технических целей, например, для фиторемедиации почв, т.е. очищения загрязненных территорий с помощью растений, которые способны через корни поглощать различные соединения, расщеплять их и либо использовать для построения организма, либо накапливать без вреда для себя. Основная связанная с этим проблема заключается в том, что процесс очищения протекает очень медленно и полностью останавливается в зимний период. Поэтому во многих случаях использование растений для фиторемедиации не имеет практического смысла, т.к. регулирующие органы устанавливают достаточно жесткие сроки очищения загрязненных территорий. Сейчас для очистки почв применяют химические средства дезактивации или срезают верхний слой, проводя захоронение его в специальных местах. Однако можно заставить растения поглощать из почвы эти соединения, очищая её. Так, профессор биологии Норман Терри (Norman Terry) из алифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) с помощью генной инженерии более чем в пять раз увеличил способность растений индийской горчицы поглощать из почвы селен. Растение преобразовывало селен в безопасное летучее соединение, которое через листья выделялось в воздух. Терри полагает, что генетически модифицированные растения решат эту проблему намного дешевле всех прежних способов. Сейчас многие компании работают над тем, чтобы растения поглощали из почвы ртуть, медь и другие токсичные «тяжелые металлы».

Ученые Вашингтонского университета, университета штата Орегон и университета Пердью (штат Индиана), работающие под руководством доктора Шэрон Доти (Sharon Doty), утверждают, что созданные ими генетически модифицированные тополя в лабораторных условиях поглощают до 91% трихлорэтилена — наиболее частого загрязнителя грунтовых вод в США. Обычные растения поглощают не более 3% этого соединения. Кроме того, растущие в пробирках экспериментальные тополя, высота которых составляет всего несколько дюймов, расщепляют трихлорэтилен до безопасных соединений в 100 раз быстрее, чем не трансформированные растения.

Правда, прежде чем внедрять эти способы очистки, нужно выяснить — что произойдет с очищаемыми экосистемами, если такое растение съест насекомое, а само насекомое — съест птица и так далее по пищевой цепочке. В общем, безопасность новых методов рекультивации почвы и очистки грунтовых вод пока остаётся под вопросом.

В последнее время очень многие люди из-за плохой экологической обстановки страдают от аллергии, которая вызывается, в частности, различными белками. Последние достижения биотехнологии позволили идентифицировать большое количество содержащихся в пище специфических молекул, вызывающих аллергические реакции. Растения, не содержащие таких белков, позволят сохранить здоровье миллионам людей. Так, в Европе примерно 4% взрослых и 8% детей страдают аллергией на различные продукты питания, и каждый седьмой из них — аллергией на томаты. Поэтому не удивительно, что результатом одной из первых работ по созданию не вызывающих аллергии биотехнологических культур стали разработанные немецкими учеными из Friedrich-Alexander University и Paul-Ehrlich-lnstitut гипоаллергенные помидоры, которые содержат на 90% меньше аллергенного вещества (белок профилин) чем плоды традиционных сортов. Экстракты обычных и трансгенных томатов прошли тестирование с участием 16 пациентов с подтвержденным диагнозом аллергии на томаты. Результаты эксперимента показали, что у пациентов, чувствительных только к профилину, помидоры нового сорта практически не вызывали аллергической реакции. В случае аллергии на два или более томатных аллергена эффект был гораздо менее выражен.

Огромное количество современных лекарств производится с помощью биотехнологии. Чаще всего для продукции человеческих белков ученые генетически модифицируют бактерии, дрожжи или животные клетки. Синтезируемые клеточными культурами белки очищаются и затем используются в качестве лекарственных препаратов. Эти методы обеспечивают производство качественных препаратов, однако они трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и расходных материалов, а также обладают ограниченной производительностью.

В течение нескольких лет ученые университета Гента (University of Ghent) (Бельгия) занимаются разработкой метода синтеза человеческих белков в семенах растений. Из всех частей растительного организма исследователи выбрали именно семена благодаря высокому по сравнению с другими частями растений содержанию белка и возможности хранения в течение довольно длительного времени без потери полезных свойств. Исследователи считают, что использование растений для производства лекарств способно снизить производственные затраты в 10—100 раз, а также обеспечить возможность крупномасштабного производства без значительных финансовых инвестиций.

Несколько лет назад группе Г и рта Де Йегера (Geert De Jaeger) удалось создать генетически модифицированные растения, более трети белка семян которых составлял целевой терапевтический протеин. Полученные антитела имели очень простую структуру, в которую входил лишь один центр связывания с антигеном. Недавно другая группа ученых, работающая под руководством Энн Депикер (Ann Depicker), продемонстрировала возможность синтеза в семенах резушки Таля (Arabidopsis thaliana) более сложных антител. Обладающие, подобно человеческим молекулам-прототипам, двумя центрами связывания, эти новые сложные антитела составляли более 10% от всех входивших в состав семян белков. Однако следует отметить, что механизм продукции белков в растительной клетке отличается от механизма, задействованного в клетках человека. Для получения доказательств того, что отличия в механизме синтеза не влияют на эффективность потенциальных лекарственных средств, ученые подвергли выделенные из семян растений антитела разнообразным лабораторным тестам. Все полученные результаты указывают на то, что синтезируемые растениями антитела предотвращают инфицирование животных клеток вирусом гепатита А так же эффективно, как и полноценные человеческие антитела.

Поскольку широкомасштабное коммерческое производство ГМ-растений начинали химические концерны, производящие различные гербициды и пестициды, совсем не удивительно, что первым и главным в их работе над созданием трансгенных растений была задача получить растения, устойчивые к выпускаемым ими гербицидам. Поэтому первыми были созданы генно-модифицированные растения, устойчивые к гербицидам глифосату и метотрексату. Существующие технологии их создания позволили фермерам на первых порах несколько снизить количество используемых химических пестицидов. Однако практически одновременно с широкомасштабным выходом на поля устойчивых к раундапу (действующее вещество — глифосат) появились и устойчивые к глифосату сорняки, так называемые «суперсорняки», которые в последние годы становятся все большей проблемой для сельскохозяйственных производителей.

В настоящее время ученые многих стран работают над созданием растений, устойчивых к другим гербицидам. Так, ученые университета Небраски, работающие под руководством Дона Уикса (Don Weeks), изолировали из генома бактерий Pseudomonas maltophilia, ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду дикамба, который избирательно уничтожает двудольные растения и не оказывает влияния на однодольные. Это обусловило его популярность для обработки полей, засеянных кукурузой и другими злаками. Им удалось встроить этот ген в ДНК табака, сои, томатов и используемой в качестве экспериментальной модели резушки Таля. Во всех без исключения случаях ГМ-растения приобретали устойчивость к гербициду. Полученное учеными гербицидо-устойчивые двудольные культуры, такие как соя и томаты, позволят расширить область применения дикамбы. Дикамба сохраняется в почве только в течение нескольких месяцев и практически не попадает в почвенные воды. Химическая структура соединения стабильна, однако оно быстро разлагается почвенными микроорганизмами. Специалисты считают, что новые устойчивые к дикамбе культуры быстро приобретут популярность среди фермеров и, учитывая опыт многолетнего использования пестицида, надеются, что масштабное выращивание таких культур не приведет к появлению устойчивых к дикамбе сорняков.

В 2005 г. японские ученые опубликовали данные, согласно которым встраивание в геном риса гена человеческого цитохрома обеспечивает расщепление ряда гербицидов, что позволит уменьшить загрязнение рисовых полей и водоемов. Авторы также продемонстрировали улучшение способности трансгенных растений поглощать из раствора хлороформ (побочный продукт дезинфекции воды), четыреххлористый углерод (растворитель) и хлористый винил (основа некоторых пластмасс). При тестировании способности растений очищать воздух 6-дюймовые (около 15 см) тополя, выращиваемые в закрытых контейнерах, показали повышенную способность абсорбировать газообразный трихлорэтилен и бензол (растворитель, производное нефти).

В основном создание трансгенных растений в настоящее время развивается по следующим направлениям:
Получение сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к нескольким листогрызущим насекомым
Получение сортов сельскохозяйственных культур с более высокой урожайностью
Получение сельскохозяйственных культур, дающих несколько урожаев в год (например, в России существуют ремонтантные сорта клубники, дающие два урожая за лето)
Создание сортов сельскохозяйственных культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, в России ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок)
Создание сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона)
Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака, синтезирующий лактоферрин человека).
Уже более 15 лет в мире выращивают генетически модифицированные (ГМ), сорта основных сельскохозяйственных культур. Общая площадь под ними к 2010 году достигла 134 млн. га, и ее годовой прирост за последние годы превысил 10%.
 
Основные ГМ-культуры на 2005 год
 
 Культура
Площадь посевов, млн га
% общей площади
Соя, устойчивая к гербициду
54,4
60
Bt-кукуруза
11,3
13
Кукуруза, устойчивая к насекомым-вредителям и гербициду
6,5
7
Bt-хлопчатник
4,9
5
Рапс, устойчивый к гербициду
4,6
5
Хлопчатник, устойчивый к вредителям и гербициду
3,6
4
Кукуруза, устойчивый к гербициду
3,4
4
Хлопчатник, устойчивый к гербициду
1,3
2
Итого
90
100

        
Наибольшие площади в мире приходятся на посевы ГМ сортов сои, устойчивых к обработке тем или иным гербицидом, главным образом к раундапу. В 2005 г. их выращивали на общей площади 54,4 млн га, что составило около 60% всей площади под ГМ-культурами. Самые значительные коммерческие посевы этой культуры сегодня отмечены в США, Аргентине, Бразилии, Парагвае, Канаде, Уругвае, ЮАР и Мексике. Следующей по значимости культурой стала устойчивая к воздействию насекомых-вредителей Bt-кукуруза, занимавшая 11,3 млн га, или 13% всей площади под ГМ-сортами. На третье место вышла кукуруза, «устойчивая» одновременно к гербициду и насекомым-вредителям.

К концу 2005 г. ГМ-сорта возделывали 8,5 млн фермеров в 21 стране, причем 90% из них — были небогатыми крестьянами из таких развивающихся стран, как Аргентина, Бразилия, Индия. На момент внедрения ГМО в сельскохозяйственное производство этих стран существовала надежда на то, что рост доходов мелких и средних производителей ГМ-культур за счет применения агробиотехнологий будет способствовать борьбе с бедностью в мире, объявленной ООН в «Повестке дня на XXI век» важнейшей задачей цивилизации. Однако уже в 2006 году выяснилось, что этим надеждам, по-видимому, не суждено оправдаться. В местные, а затем и в мировые СМИ просочились данные о том, что как в Индии, так и в Аргентине наметилась стойкая тенденция к разорению мелких фермеров производивших ГМ-хлопчатник и ГМ-сою, что привело к повышению социальной напряженности в этих странах. В Индии дело дошло до массовых беспорядков у офисов продавцов ГМ-семян и даже до самоубийств разорившихся крестьян. Выяснилось, что производство ГМ-культур рентабельно лишь на крупных площадях, а мелкие и средние производители имеют шанс лишь в лучшем случае свести концы с концами.

И в заключение о том, имеется ли принципиальное отличие методов генной инженерии от методов традиционной селекции (из интервью с проф. Л.А. Лутовой, интернет-журнал «Коммерческая биотехнология», 2007 г.).
Обе технологии имеют единую цель — создание новых форм организмов, наделенных необходимыми человеку признаками. Основные методы селекции - скрещивание и отбор. При скрещивании объединяют полные наборы генов двух разных организмов. Далее отбирают то потомство, которое несет интересующие нас гены, и с ним работают. При каждом новом скрещивании гены снова перетасовываются. При этом есть существенное ограничение — скрещиваются между собой только близкородственные организмы, так как природа создала специальные клеточные барьеры для поддержания постоянства генетического состава организма данного вида.

Что делают генные инженеры? То же самое, только переносят в организм всего лишь один или два гена, которые отвечают именно за тот признак, который хотят добавить растению. Однако принципиальное отличие генно-инженерных технологий от подходов традиционной селекции заключается в том, что при получении генно-модифицированных растений ген любого организма может быть перенесен в геном любого другого организма, то есть в этом случае нарушается запрет, выработанный в ходе эволюции, на обмен генетической информацией между различными видами организмов.
Обычные методы селекции не позволяют сохранить некоторые полезные свойства при внесении еще одного. Например, создавая сорт картофеля с хорошими питательными качествами и высокой урожайностью, зачастую теряют устойчивость к заморозкам и вредителям. Генная инженерия, в идеале, служит тому, чтобы «улучшить хорошее» — добавить недостающие свойства, которые либо никогда не существовали, либо были потеряны при селекции. В то же время, надо отметить, что ученые уже умеют заставить нужный ген встроиться в структуру ДНК, однако пока не могут проконтролировать, в каком именно участке хромосомы произойдет вставка. Сами хромосомы по своей структуре неоднородны. Есть участки, где гены экспрессируются, — с них считывается информация — а есть и другие, где гены молчат (гетерохроматиновые области). Если ген встраивается именно в такие области, то мы не добьемся результата. Более того, даже если встройка произошла на активном участке, это может привести к замолканию какого-нибудь функционирующего гена, то есть он может встроиться посередине какого-то гена, разрубив его пополам. А этот ген может оказаться очень важным как для самого растения, так и для последующего потребителя его продукта. На сегодня процесс встраивания — абсолютно вероятностный. Все клетки, в которые вошел новый ген, получаются разными за счет разных мест встраивания. Именно поэтому, когда мы получаем определенное количество генно-модифицированных растений, обязательно наступает следующий этап — отобрать те из них, в которых новый ген не нарушил статус-кво, а лишь добавил новый признак.
Например, картофель был продуктивным, а в результате продуктивность была потеряна из-за нарушения одного или нескольких генов. Такой отбор осуществляется в нескольких поколениях. Это относительно длительный процесс, большая, кропотливая и дорогостоящая работа. Иногда для генного инженера удача, если удается получить хотя бы одно растение с полным набором требуемых признаков. И, если говорить о безопасности генно-модифицированных растений, то можно это делать только в отношении конкретной линии конкретного вида растения.

И, последнее, прежде чем новый трансгенный сорт будет зарегистрирован, он должен пройти испытания на биологическую и пищевую безопасность. Это закреплено в законодательстве России и, надеюсь, неукоснительно выполняется. Все необходимые мероприятия достаточно длительные и очень затратные для компаний-разработчиков. На сегодняшний день зарегистрировано 18 сортов растений, продукты получаемые из которых могут употребляться в пищу на территории нашей страны. Пока что законодательно трансгенные растения не разрешается выращивать на полях Российской Федерации, поскольку ни один, даже из зарегистрированных сортов, не прошел необходимой для этого экологической экспертизы. Исключение составляют экспериментальные поля, на которых в ходе испытаний на пищевую безопасность проверяется способность растений давать потомство, нормально развиваться, поддерживать новый признак и т.д. К таким полям предъявляются повышенные карантинные требования, не допускающие «расползания» семян растений на другие территории.

Таким образом, мы вкратце рассмотрели, что же такое генетически модифицированные организмы и, хочется надеяться, что аббревиатура ГМО, часто встречающаяся как в СМИ, так и на упаковках некоторых пищевых продуктов, стала понятнее. Разобрали, как же их получают, какие методы при этом используют, какие потенциальные опасности они могут нести и какую пользу могут принести. Но, самое главное, надеюсь, уяснили, что всё новое должно быть тщательно проверено, прежде чем применяться человеком. Здесь всегда надо помнить слова из Клятвы Гиппократа, которую дают медики, но которые подходят и во многих других случаях: «Не навреди!».

Настоящая работа частично поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (Подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие»).


Ралдугина, Г.Н. Трансгенные организмы: как и для чего их получают // Биология для школьников. – 2011. - № 1. – С. 2-23